2024-01-15 09:46:04
1、介紹
中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的培養(yǎng)滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)和細(xì)胞體積與特定的重組蛋白生產(chǎn)力相關(guān),生物合成能力和營養(yǎng)交換取決于細(xì)胞大小,而細(xì)胞大小又受到培養(yǎng)物滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的影響,已知高滲條件會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞體積增加。
細(xì)胞大小是特定蛋白質(zhì)生產(chǎn)力的決定因素。盡管每個(gè)細(xì)胞周期階段的細(xì)胞都具有生產(chǎn)力,但G2/M期的細(xì)胞表現(xiàn)出最高的生產(chǎn)力。
在某些研究中,滴度的增加伴隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量的變化,特別是在糖基化方面,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)可以降低Fc融合蛋白的N-糖中酸性異構(gòu)體和唾液酸含量的比例,這可以通過添加甜菜堿來避免。
同樣,在補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段,滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)濃度增加60-120mOsm/kg會(huì)導(dǎo)致未充分加工的聚糖的分泌。
2、結(jié)果和討論
一、高滲透壓對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的影響
圖1:中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)速率與細(xì)胞外滲透壓的函數(shù)關(guān)系。
我們?cè)诮臃N前向培養(yǎng)基中加入NaCl或補(bǔ)料C,以獲得320至500 mOsm kg?1之間的初始滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值。如圖1所示,在這兩種情況下,滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的增加導(dǎo)致最大特定細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著降低。兩種處理方式的最大生長(zhǎng)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
不同滲透壓條件下細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)隨時(shí)間的變化曲線
活細(xì)胞密度曲線如圖2A所示隨著鹽或補(bǔ)料的添加滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)濃度增加,生長(zhǎng)速率明顯降低。這些發(fā)現(xiàn)表明,添加補(bǔ)料會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長(zhǎng),在(添加補(bǔ)料C)滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)達(dá)到500 mOsm kg?1的情況下可以清楚地看到這一點(diǎn)。在培養(yǎng)過程中,滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值增加(圖2B),主要是由于細(xì)胞外乳酸、Na+和K+的積累(圖2,分別為E、G和H)。
直到第5天,平均細(xì)胞直徑與滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)呈正相關(guān)(圖2C),其值在接種后24小時(shí)快速增加,特別是對(duì)于添加補(bǔ)料C超過410 mOsm kg?1與對(duì)照組相比非常明顯。然而,從第6天開始,當(dāng)對(duì)照和添加NaCl的培養(yǎng)物中的葡萄糖和谷氨酸等關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)開始耗盡時(shí),趨勢(shì)發(fā)生了變化(圖2F、2I)。
氨濃度(圖2D)呈逐漸增加的趨勢(shì),但只有3種條件超過5mM,對(duì)該細(xì)胞系[36]有明顯的抑制作用。然而,在所有情況下,這一閾值是在靜止期或后期培養(yǎng),很可能不損害達(dá)到高峰細(xì)胞密度。圖2E,F分別顯示細(xì)胞外乳酸菌和葡萄糖的分布,其中前者從產(chǎn)生到消耗的轉(zhuǎn)變僅在對(duì)照和320mOsmkg-1條件下進(jìn)行。其余的培養(yǎng)物在整個(gè)培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出持續(xù)的乳酸產(chǎn)生,在一些添加NaCl的培養(yǎng)物中,乳酸似乎來自葡萄糖以外的其他來源。從乳酸產(chǎn)生到消耗的轉(zhuǎn)變被認(rèn)為取決于培養(yǎng)液的pH值。
圖3 不同滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)條件下(A)氨、(B)葡萄糖、(c)谷氨酸、(D)谷氨酰胺和(E)乳酸的特定攝取/產(chǎn)生速率。對(duì)照培養(yǎng)物未產(chǎn)生可檢測(cè)水平的谷氨酰胺。誤差條表示兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于顯著性分析(*p<0.05),假設(shè)不同實(shí)驗(yàn)之間每個(gè)變量的方差相等.
圖3顯示了指數(shù)生長(zhǎng)階段(即根據(jù)第0天至第6天的數(shù)據(jù)計(jì)算)我們觀察到了恒定的滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值。與對(duì)照組相比,所有培養(yǎng)物的特定葡萄糖消耗率都較高,盡管表現(xiàn)出較低的特定細(xì)胞生長(zhǎng)率。無論隨后的高滲處理如何,隨著滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的增加,葡萄糖上的乳酸產(chǎn)量都更高,這表明無論誘導(dǎo)方法如何,碳代謝都不充分。先前已經(jīng)報(bào)道,在較高的殘留葡萄糖濃度下,葡萄糖上的乳酸產(chǎn)量增加。事實(shí)上,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指向相同的表型。比較使用相同誘導(dǎo)方法的培養(yǎng)物之間的殘留葡萄糖濃度(圖2F),我們發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度越高,在細(xì)胞生長(zhǎng)期(兩天的初始適應(yīng)期,隨后是指數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng))內(nèi)乳酸的產(chǎn)生率就越高(圖3E)。這種行為在培養(yǎng)后期仍在繼續(xù),在正常滲透壓條件下(對(duì)照和370mOsm kg?1 NaCl)的兩種培養(yǎng)物顯示出乳酸濃度的快速下降,這是由于細(xì)胞將代謝產(chǎn)物作為碳源重新內(nèi)化所致(圖2E)。在加入NaCl的最高滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)培養(yǎng)物的情況下,產(chǎn)生的乳酸鹽的一部分似乎來自糖酵解以外的來源。先前有報(bào)道稱,谷氨酸解酶可以在癌癥細(xì)胞中提供碳和氮,已知這些細(xì)胞與CHO細(xì)胞具有相似的代謝特征。有趣的是,當(dāng)滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值在410-420mOsm kg?1范圍內(nèi)時(shí),在兩種高滲誘導(dǎo)策略下,氨的產(chǎn)生率沒有顯著差異。然而,這種變化在460–470 mOsm kg?1范圍內(nèi),其中NaCl培養(yǎng)物表現(xiàn)出顯著更高的氨生成率(p<0.05)。具體而言,添加NaCl的培養(yǎng)物比添加補(bǔ)料C的實(shí)驗(yàn)分泌更多的氨(圖3A)。這與各自的谷氨酰胺生產(chǎn)速率一致,后者使用氨合成和分泌谷氨酰胺的速率高于前者(圖3D)。然而,谷氨酸的攝取/生產(chǎn)速率并不遵循相同的模式,460–470 mOsm kg?1范圍內(nèi)的NaCl培養(yǎng)物消耗谷氨酸,而補(bǔ)料C培養(yǎng)物分泌谷氨酸。鑒于補(bǔ)料C富含氨基酸,我們假設(shè)這些培養(yǎng)物將其他氨基酸轉(zhuǎn)化為谷氨酸,然后用于合成谷氨酰胺。有趣的是,500 mOsm kg?1的培養(yǎng)物表現(xiàn)不同,表現(xiàn)出氨和谷氨酸產(chǎn)量增加,谷氨酰胺分泌減少,表明在這些高滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)、營養(yǎng)豐富的條件下有不同的代謝途徑。
二、高滲壓對(duì)滴度和特異性抗體生產(chǎn)率及糖基化的影響
圖4顯示了所有培養(yǎng)物收獲時(shí)的mAb滴度和各自的整體活細(xì)胞密度(IVCD)值。最高滴度為410 mOsm kg?1,添加補(bǔ)料C也顯示出最高的IVCD,盡管后者與對(duì)照培養(yǎng)物沒有顯著差異。在另一端,500 mOsm kg?1補(bǔ)料C培養(yǎng)物的IVCD和mAb滴度最低。總的來說,滴度大致遵循與IVCD相同的趨勢(shì),470 mOsm kg?1 NaCl培養(yǎng)物除外。從圖5中的特定mAb生產(chǎn)力我們可以看到,在所有條件下,470 mOsm kg?1 NaCl培養(yǎng)物的mAb分泌率最高。這不僅高于對(duì)照培養(yǎng)物,而且明顯高于所有添加補(bǔ)料C培養(yǎng)物。有趣的是,補(bǔ)充NaCl的培養(yǎng)物顯示出特定mAb生產(chǎn)力的增加,這與滲透壓值呈正相關(guān),而添加補(bǔ)料C的培養(yǎng)物在三種不同的滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。這可能源于后一種培養(yǎng)物由于葡萄糖豐度高,對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率較低。此外,470 mOsm kg?1 NaCl和410 mOsm kg?1補(bǔ)料C培養(yǎng)物在第6天后表現(xiàn)出明顯更大的細(xì)胞直徑,如圖2C所示。
兩種高滲誘導(dǎo)方法對(duì)收獲時(shí)mAb糖基化的影響如圖6所示。在添加NaCl的培養(yǎng)物中,聚糖分布沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p>0.05)。然而,添加更多補(bǔ)料C的培養(yǎng)物顯示,隨著滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的增加,G0F下降(410和500 mOsm kg?1之間的差異為18%)。這伴隨著G0的增加(410和500 mOsm kg?1之間的差異為10%)和半乳糖基化百分比的較小增加(G1F、G10F和G2F)。然而,毫不奇怪,表現(xiàn)出最高物種生產(chǎn)力(410 mOsm kg?1補(bǔ)料c)的培養(yǎng)物也顯示出非半乳糖基化的百分比增加。另一方面,抗體合成和分泌的高速率可能限制了抗體在高爾基體中的停留時(shí)間,因此降低了負(fù)責(zé)mAb半乳糖基化的b-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(b4GalT)對(duì)聚糖的進(jìn)一步加工程度。與預(yù)期的非半乳糖基化結(jié)構(gòu)的分布增加相反,核心巖藻糖基化在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出意想不到的行為,包括添加補(bǔ)料C以調(diào)節(jié)滲透壓。如圖6所示,最高滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)條件(500 mOsm kg?1補(bǔ)料C)的核心巖藻糖基化水平明顯低于410 mOsm kg?1補(bǔ)料C樣品(p<0.05),盡管其特異性抗體生產(chǎn)率較低。上述觀察結(jié)果可能表明,由于較高的滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)水平,a-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FucT)酶活性受到抑制或基因(Fut8)表達(dá)減少,假設(shè)核心巖藻糖化的共底物GDP巖藻糖的水平不受滲透壓變化的影響。
三、高滲透壓對(duì)細(xì)胞體積的影響
在研究了CHO細(xì)胞培養(yǎng)開始時(shí)添加補(bǔ)料和鹽誘導(dǎo)的高滲性的影響后,我們?cè)谏锓磻?yīng)器中觀察了一組典型的補(bǔ)料CHO細(xì)胞。后者更好地代表了典型的生產(chǎn)條件,在這種條件下,由于營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充和代謝物的產(chǎn)生,細(xì)胞外滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)比初始值增加了70%,此前有報(bào)道稱,這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞體積增加四倍。此外,在生物反應(yīng)器環(huán)境中,我們可以有效地控制培養(yǎng)物的pH,但也可以探索在指數(shù)生長(zhǎng)期間將溫度轉(zhuǎn)移到溫和低溫條件的影響,這是延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間和提高產(chǎn)品滴度的常用策略。在我們的生物反應(yīng)器研究中,代謝在36.5℃時(shí)更活躍、 其中葡萄糖和乳酸兩者比在亞低溫下更容易被消耗。這導(dǎo)致滲透壓摩爾濃度在36.5時(shí)緩慢增加,用于相同的補(bǔ)料計(jì)劃(圖7a)。將平均細(xì)胞大小繪制為滲透壓濃度的函數(shù),說明了滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)濃度對(duì)細(xì)胞體積的影響(圖7b)。
結(jié)果
在CHO細(xì)胞的Fed-Batch培養(yǎng)模式下,補(bǔ)料的添加和代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致后期培養(yǎng)液物中細(xì)胞外滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的增加。
通過NaCl調(diào)節(jié)滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)至470 mOsm/kg時(shí)對(duì)抗體產(chǎn)率和滴度具有促進(jìn)作用,但是通過補(bǔ)加Feed C提高了mAb產(chǎn)率,但細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著降低且導(dǎo)致半乳糖基化水平比例顯著降低。
3、結(jié)論
在本研究中,我們檢測(cè)了高滲條件對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞體積和抗體產(chǎn)生的影響。我們比較了兩種誘導(dǎo)高滲性的方法,添加NaCl和添加補(bǔ)料C。滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體滴度的影響程度差異很大,取決于滲透壓的值以及增加滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的方法。這是因?yàn)?,盡管高滲條件在所有條件下都提高了特定抗體的生產(chǎn)力,但它們也對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響,這意味著在某些情況下總滴度低于對(duì)照。令人驚訝的是,與補(bǔ)充補(bǔ)料C的培養(yǎng)物相比,補(bǔ)充NaCl的培養(yǎng)物表現(xiàn)出更一致的行為,這表明過量營養(yǎng)物添加對(duì)生長(zhǎng)速率的不利影響。
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