細(xì)胞組織張力和細(xì)胞滲透壓以促進(jìn)小腸隱窩形成

2021-12-08 18:23:00

類器官作為近十年來(lái)新興的三維組織培養(yǎng)模型，其優(yōu)勢(shì)在于可以在體外一定程度上復(fù)制體內(nèi)組織的細(xì)胞組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)乃至生理學(xué)功能。作為體外培養(yǎng)系統(tǒng)，類器官比起哺乳動(dòng)物模型更易于在單細(xì)胞及分子層面上進(jìn)行基于成像的大規(guī)模表型分析。該課題正是利用小腸類器官的優(yōu)勢(shì)，克服了小腸作為內(nèi)臟難以進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞實(shí)時(shí)活體成像的困難，結(jié)合物理學(xué)模型分析，對(duì)富集小腸成體干細(xì)胞的隱窩組織（crypt）的形態(tài)發(fā)育進(jìn)行了突破性的研究。

在類器官里小腸隱窩的發(fā)育始于潘氏細(xì)胞（Paneth Cell）的出現(xiàn)。潘氏細(xì)胞分泌Wnt 等干細(xì)胞誘導(dǎo)因子，促進(jìn)干細(xì)胞的生成。干細(xì)胞和潘氏細(xì)胞聚集形成隱窩組織，隆起并逐漸發(fā)育為成熟的芽狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)對(duì)于隱窩維持小腸干細(xì)胞庫(kù)至關(guān)重要，但此形態(tài)發(fā)生的發(fā)育過(guò)程和機(jī)制由于小腸活體研究的難操作性長(zhǎng)期缺乏足夠的研究。

Liberali組首先通過(guò)對(duì)細(xì)胞連接蛋白的免疫熒光染色和成像，分割出小腸絨毛組織(villus) 和隱窩組織（crypt）內(nèi)所有細(xì)胞的頂膜（apical membrane，上皮細(xì)胞對(duì)應(yīng)腔體的細(xì)胞膜）及基底膜（basal membrane，上皮細(xì)胞對(duì)應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞膜，通常位于頂膜的對(duì)立面）的形狀。近萬(wàn)單細(xì)胞頂膜和基底膜的統(tǒng)計(jì)結(jié)果確定了絨毛組織基底膜和隱窩組織頂膜顯著收縮的表型。通過(guò)激光片層掃描顯微鏡長(zhǎng)時(shí)間追蹤記錄帶有熒光蛋白標(biāo)記的類器官發(fā)育過(guò)程和利用機(jī)器學(xué)習(xí)分割組織的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)隱窩形成伴隨類器官腔內(nèi)空間的劇烈減小。

細(xì)胞膜收縮和腔體體積減小均屬于組織形態(tài)變化的一部分，而形態(tài)的變化受機(jī)械力的調(diào)控。為了充分理解這兩種表型背后的力學(xué)原理，以及它們與隱窩芽狀結(jié)構(gòu)形成的相關(guān)性，Hannezo組設(shè)計(jì)了涵蓋細(xì)胞頂-基極性、單細(xì)胞結(jié)構(gòu)、絨毛-隱窩組織區(qū)域劃分、組織厚度和類器官腔體大小的三維頂點(diǎn)模型（3D vertex model）。通過(guò)模型演算和實(shí)驗(yàn)測(cè)量對(duì)比，最終確定絨毛和隱窩組織在頂-基極性上相反的組織張力可以導(dǎo)致隱窩出芽。Liberali組通過(guò)在活細(xì)胞膜上的激光切割和顯微吸量實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)出課題最初測(cè)量到的絨毛組織基底膜和隱窩組織頂膜顯著收縮直接對(duì)應(yīng)其更強(qiáng)的組織張力，至此為力學(xué)機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)支持。絨毛組織基底膜和隱窩組織頂膜對(duì)應(yīng)的強(qiáng)組織張力分布由該課題命名為組織自發(fā)性彎曲, 對(duì)應(yīng)脂質(zhì)雙分子膜領(lǐng)域內(nèi)的自發(fā)性彎曲（spontaneous curvature）經(jīng)典力學(xué)模型。進(jìn)一步模型演算推導(dǎo)出腔體體積減小可以極大促進(jìn)隱窩出芽過(guò)程，而該機(jī)制也符合傳統(tǒng)自發(fā)性彎曲力學(xué)模型的原理。一系列調(diào)節(jié)類器官組織張力和腔體體積的實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了模型理論的正確性。并且模型預(yù)測(cè)到一種從未檢測(cè)過(guò)的新表型也得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的吻合，即隱窩出芽后腔體即使被誘導(dǎo)極端膨脹，也不會(huì)消除已經(jīng)形成的芽狀結(jié)構(gòu)。此表型解釋了生理學(xué)上，當(dāng)腹瀉的癥狀發(fā)生時(shí)，小腸隱窩可以保持芽狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而維護(hù)干細(xì)胞群和腸道上皮的穩(wěn)態(tài)。

接下來(lái)Liberali組通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序、蛋白表達(dá)成像、藥物處理等功能性研究結(jié)合類器官個(gè)體和單細(xì)胞水平的大規(guī)模圖像分析統(tǒng)計(jì)確定了組織自發(fā)性卷曲和腔體體積縮小的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制。其中組織自發(fā)性卷曲主要由非肌細(xì)胞肌動(dòng)球蛋白產(chǎn)生的細(xì)胞膜上的機(jī)械力導(dǎo)致。而干細(xì)胞和潘氏細(xì)胞都具有產(chǎn)生頂膜張力的能力，且干細(xì)胞產(chǎn)生的頂膜張力更強(qiáng)。分化的絨毛組織的腸上皮細(xì)胞（enterocyte）則產(chǎn)生獨(dú)特的基地膜張力。有趣的是，細(xì)胞分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)暗示腔體縮小也是由腸上皮細(xì)胞引起。模型推算同時(shí)得出類器官的總體積大致不變，腔體體積劇烈變小，如果腔體體積轉(zhuǎn)移到絨毛組織，力學(xué)上對(duì)隱窩出芽的幫助遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)移到其他組織里。類器官單細(xì)胞體積和小鼠腸道上皮單細(xì)胞大小測(cè)量均支持腸上皮細(xì)胞的體積增加對(duì)應(yīng)腔體體積減小。最終通過(guò)篩選測(cè)試一系列和吸收功能有關(guān)的蛋白及蛋白功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了小腸上皮細(xì)胞細(xì)胞膜上的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）吸收腔內(nèi)液體進(jìn)而縮小腔體體積。