2020-06-02 19:09:00
藥物的含量是指藥物中所含主成分的量,是評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量的重要指標(biāo)。藥物的含量通常運(yùn)用化學(xué)、物理學(xué)或生物學(xué)及微生物學(xué)的方法測(cè)定,它是評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量的主要手段,也是藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容。藥物的含量測(cè)定可分為兩大類,即基于化學(xué)或物理學(xué)原理的“含量測(cè)定”和基于生物學(xué)原理的“效價(jià)測(cè)定”。其中,效價(jià)測(cè)定法(包括生物檢定法、微生物檢定法、酶法)的方法建立與驗(yàn)證過程各具特殊性,本章將主要探討基于化學(xué)或物理學(xué)的“含量測(cè)定”。
藥物含量測(cè)定的分析方法主要包括:容量分析法(滴定法)、光譜分析法和色譜分析法。其中,容量分析法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,方法耐用性高,當(dāng)方法缺乏專屬性,主要適用于對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確度與精密度要求較高的藥品測(cè)定;光譜分析法簡(jiǎn)便快速,靈敏度高,并具有一定的準(zhǔn)確度,但方法專屬性稍差,主要適用于對(duì)靈敏度要求較高、樣本量較大的分析項(xiàng)目;色譜分析法則具有高靈敏度與高專屬性,并具有一定的準(zhǔn)確度,但其結(jié)果計(jì)算需要對(duì)照品,本法主要使用于對(duì)方法的專屬性與靈敏度要求較高的復(fù)雜樣品的含量測(cè)定。
一、容量分析法
容量分析法(也叫滴定法),是將已知濃度的滴定液(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液)由滴定管滴加到被測(cè)藥物的溶液中,直至滴定液中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(常稱為滴定劑)與被測(cè)藥物反應(yīng)完全(通過適當(dāng)方法指示),然后根據(jù)滴定液中滴定劑的濃度(一般稱為滴定液濃度)和被消耗的體積,按化學(xué)計(jì)量關(guān)系計(jì)算出被測(cè)藥物的含量。
(一)容量分析法的特點(diǎn)與使用范圍
1.容量分析法的特點(diǎn)
(1)方法簡(jiǎn)便易行:本法所用儀器價(jià)廉易得,操作簡(jiǎn)便、快速。
(2)方法耐用性高:影響本法測(cè)定的試驗(yàn)條件與環(huán)境因素較少。
(3)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確:通常情況下本法的相對(duì)誤差在0.2%以下,適用于對(duì)準(zhǔn)確度要求較高的試樣的分析。
(4)方法專屬性差:本法對(duì)結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)物質(zhì)或其他干擾測(cè)定的雜質(zhì)缺乏選擇性,故一般適用于主成分含量較高的試樣的分析。
2.容量分析法的使用范圍
由于容量分析法具有以上特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于化學(xué)原料藥物的含量測(cè)定,而較少應(yīng)用于藥物制劑的含量測(cè)定。
(二)容量分析法的有關(guān)計(jì)算
1.滴定度
指每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y(cè)藥物的質(zhì)量,《中國(guó)藥典》用毫克(mg)表示。例如用碘量法測(cè)定維生素C的含量時(shí),ChP規(guī)定:每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6(維生素C)。
2.滴定度的計(jì)算通式
T(mg/ml)=m×(a/b)×M
式中,m為滴定液的摩爾濃度(mol/L);a、b分別為滴定反應(yīng)式中被測(cè)藥物與滴定劑的摩爾數(shù);M為被測(cè)藥物的毫摩爾質(zhì)量(分子量,以mg表示)。
3.含量的計(jì)算
此法測(cè)定藥物含量時(shí)候,有直接滴定和間接滴定兩種。
(1)直接滴定法:本法是用滴定液直接滴定被測(cè)藥物,則被測(cè)藥物的百分含量計(jì)算公式如圖所示,
式中,W是稱取量,V是消耗體積,T是滴定度
(2)間接滴定法:包括生成物滴定法和剩余量滴定法。
二、光譜分析法
光譜分析法所用的波長(zhǎng)范圍包括從紫外區(qū)至紅外區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計(jì)、可見分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)、原子吸收分光光度計(jì),以及光散射計(jì)和拉曼光譜儀。
《中國(guó)藥典》收載的常用的分光光度法有:紫外-可見分光度法、紅外分光度法和原子吸收分光光度法等。
(一)紫外-可見分光光度法
本方法是在190~800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定物質(zhì)的吸光度,用于藥物的鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測(cè)定的方法。
1.朗伯比爾定律
在一定的濃度范圍內(nèi)被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比,如圖式子:
2.方法特點(diǎn)與適用范圍
(1)鑒別易行:本法使用的儀器價(jià)格較低廉,操作簡(jiǎn)單,易于普及。
(2)靈敏度高:本法靈敏度可達(dá)10-6g/ml,適用于低濃度試樣的分析。
(3)準(zhǔn)確度較高:本法的相對(duì)誤差不大于2%,適用于對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度有較高要求的試樣的分析。
(4)專屬性較差:本法通常不受一般雜質(zhì)的干擾,但對(duì)結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)物質(zhì)缺乏選擇性。
3.儀器校正和檢定
(1)波長(zhǎng):由于環(huán)境的影響,儀器的波長(zhǎng)經(jīng)常會(huì)略有變動(dòng)。除了應(yīng)定期對(duì)所用儀器進(jìn)行全面校正檢定外,還應(yīng)于測(cè)定前校正測(cè)定波長(zhǎng)。
(2)吸光度的準(zhǔn)確度:可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。
(3)雜散光的檢查:可按照表格4-2所累的試劑和濃度,制成水溶液,置1cm石英吸收池中,在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定透光率,應(yīng)符合規(guī)定。
三、色譜分析法
色譜分析法是一種分離分析方法,是根據(jù)混合物中被分離物質(zhì)的色譜行為差異,將各組分從混合物中分離后再選擇性對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行分析的方法。因此色譜分析法是分析混合物的最有力手段。色譜分析法分為:
1.依據(jù)分離方式分類
可分為紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。
2.依據(jù)分離原理分類
可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與分子排阻色譜法(凝膠色譜法)等。
(一)高效液相色譜法(HPLC)
1.方法的特點(diǎn)與適用范圍:
(1)高靈敏度:根據(jù)檢測(cè)器的不同,HPLC的最低檢出濃度可達(dá)10-12~10-9g/ml。
(2)高專屬性:HPLC可有效分離復(fù)雜基質(zhì)樣品中與被測(cè)組分結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)雜質(zhì)或無關(guān)干擾物,檢測(cè)信號(hào)具有較高的專屬性,可實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)組分的選擇性檢測(cè)。
(3)高效能與高速度:HPLC通??稍?0~20分鐘內(nèi)完成藥物的定量分析,或在30分鐘內(nèi)完成藥物復(fù)方制劑中多組分同時(shí)定量測(cè)定,也可在60分鐘內(nèi)完成藥物中有關(guān)物質(zhì)的分離與同時(shí)定量。
2.測(cè)定法
定量測(cè)定時(shí),可根據(jù)供試品或儀器的具體情況以峰面積或峰高計(jì)算。目前大多數(shù)以峰面積計(jì)算。常用兩種方法如下:
(1)內(nèi)標(biāo)法:按各品種項(xiàng)下規(guī)定,精密稱定藥物對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì),分別制成溶液,各精密量取適量,混合制成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入儀器,記錄色譜圖。分別測(cè)量藥物對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰面積或峰高,按式子計(jì)算校正因子f:
式中,AS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積(或峰高);AR為藥物對(duì)照品的峰面積(或峰高);CS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度;CR為對(duì)照品的濃度。
再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物在的供試品溶液,進(jìn)樣,記錄色譜圖,測(cè)量供試品中被測(cè)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰的峰面積或峰高,按式子計(jì)算含量:
式中,AX為供試品中被測(cè)藥物的峰面積(或峰高);cX為供試品溶液的濃度;f為校正因子;A'S和c'S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積(或峰高)和濃度。
采用內(nèi)標(biāo)法,可避免因供試品前處理及進(jìn)樣體積誤差對(duì)結(jié)果的影響。
(2)外標(biāo)法:按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精密稱量對(duì)照品和供試品,制成溶液,分別精密取一定量,進(jìn)樣,記錄色譜圖,測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中被測(cè)物質(zhì)的峰面積(或峰高),按式子計(jì)算含量:
式中,AX為供試品中被測(cè)藥物的峰面積(或峰高);AR為藥物對(duì)照品的峰面積(或峰高); CR為對(duì)照品的濃度。
外標(biāo)法簡(jiǎn)便,但要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確及操作條件穩(wěn)定。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量,當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定含量時(shí),以手動(dòng)進(jìn)樣器定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為宜。
(二)氣相色譜法(GC)
氣相色譜法采用氣體為流動(dòng)相(載氣)流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后,被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離,各組分先后進(jìn)入檢測(cè)器,用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。
1.方法的特點(diǎn)與適用范圍
本法主要應(yīng)用于具有揮發(fā)性或其衍生物具有揮發(fā)性的藥物及其相關(guān)物質(zhì)的分析,在ChP2015中被廣泛應(yīng)用于殘留溶劑測(cè)定法,也應(yīng)用于水分測(cè)定法、酒劑或酊劑中甲醇量檢查法等相關(guān)雜質(zhì)的檢查和維生素E等部分脂溶性較強(qiáng)的藥物及其制劑的含量測(cè)定等。
2.測(cè)定法
分為內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法及加入法測(cè)定。內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法同高效液相色譜法,這里主要介紹加入法:
精密稱取被測(cè)組分對(duì)照品適量,制成適當(dāng)濃度的對(duì)照品溶液,取一定量,精密加入至供試品溶液中,根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測(cè)定被測(cè)組分含量,再扣除加入的被測(cè)組分對(duì)照品的量,即得供試品中被測(cè)組分的含量。
由于加入對(duì)照品溶液前后校正因子應(yīng)相同,即:
式中,cX為供試品中被測(cè)組分X的濃度;AX為供試品中被測(cè)組分X的色譜峰面積;△cX為所加入的已知濃度的被測(cè)組分的對(duì)照品的濃度;Ais為加入對(duì)照品后被測(cè)組分X的色譜峰面積。
由于氣相色譜法的進(jìn)樣量一般僅數(shù)微升,為減小進(jìn)樣誤差,尤其當(dāng)采用手動(dòng)進(jìn)樣時(shí),由于留針時(shí)間和室溫等對(duì)進(jìn)樣量也有影響,故以采用內(nèi)標(biāo)法定量為宜;若采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí),由于進(jìn)樣重復(fù)性的提高,在保證分析誤差的前提下,也可采用外標(biāo)法定量。
當(dāng)采用頂空進(jìn)樣時(shí),由于供試品和對(duì)照品處于不完全相同的基質(zhì)中,故可采用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響;當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法與其他定量方法結(jié)果不一致時(shí),應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法結(jié)果為準(zhǔn)。
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